TP Influence de l’irradiation aux UV sur une culture de levure

I. Introduction:
L\’irradiation par les rayons ultraviolets (UV) provoque la formation de nombreuses modifications chimiques de l’ADN. Ce sujet m’est venu à l’esprit, car les rayons ultraviolets ont de nombreux effets néfastes sur la peau des êtres humains au quotidien, mais j’ai jamais réellement su la cause. En sachant qui n’est pas étique d’utiliser des êtres humains pour les expériences de recherche individuelle. J’ai mis en place cette expérience afin de prouver à quel point les rayons ultraviolets étaient néfaste pour la santé. De même que montrer pourquoi certains types des UV sont des agents mutagènes. De plus expliqué de nombreuses maladies de la peau certaines mortels que ces derniers causent comme lorsque qu’il engendre une apparition de tumeurs cancéreuses déclenché par modification chimique de l’ADN. Les UVA et en majorité les UVB déclenchent des modifications chimiques de L’ADN au niveau des bases et crée des dimères de pyrimidines. Selon leurs longueurs d’onde, les rayons UV sont classés en 3 catégories :
Les UVA (320-400 nm) sont les rayons ultraviolets les plus longs mais cependant les moins énergétiques ces derniers modifie aussi L’ADN. De même l\’absorption des UVA produits des réactions de dimérisation.
Les UVB (280-320 nm). Ces rayons ultraviolets vont en profondeur dans les tissus humains et modifient l’ADN. Ces derniers provoquent la majorité des cancers due à la lumière solaire.
Les UVC (200-280) sont les seuls rayons ultraviolets qui n’atteignent pas la surface de la Terre, car ils sont absorbés par la couche d’ozone. Cependant, ce sont les plus énergétiques.
Durant cette expérience, les levures Ade2 ont été exposés a des rayons ultraviolets de type UVC.
Une souche de levure qui porte une mutation dans le gène ade2 sera utilisé lors de cette expérimentation. Ces dernières sont rouge grâce à la pigmentation naturelle due à l’exposition à l’air suite à l’interruption de la chaîne de la biosynthèse de l’adénine. Suite au contact avec ce facteur du milieu aérobiose l’adénine est oxydé en pigment rouge d’où la couleur des levures ade2. Ces cellules seront exposées à différents temps d’exposition aux UV afin de déterminer le taux de mutation. Par la suite, nous pourrons observer l’apparition de mutations qui se caractérise par une coloration blanche des colonies.

II. Question de recherche :
De quelle manière les rayons ultraviolets créés des mutations dans les levures ade2?

III. Hypothèses :
La lumière des UV fait muter les levures.

IV. Présentation des variables :
Variables indépendantes : temps d’exposition aux UV (0 seconde; 10 secondes ; 30 secondes ; 50 secondes ; 1 minute)

Variables dépendantes : nombre de colonies mutantes

Variables contrôlées : type de souche de levure ; concentration en levure de la solution ; stérilité du champ de travail et du matériel ; température de la localisation de l’expérience

V.Matériel et méthode:
Étapes du protocole de l’expérience :
-> Nettoyer le champ de travail à l’aide l’éthanol
-> s’équiper de l’équipement de protection individuelle (EPI): lunettes de protection, d’une blouse et de gants que je garde jusqu’à l’aboutissement de mon expérience pour la sécurité
-> Désinfecter le matériel avec lesquels la solution sera en contact
-> Mélanger l’eau stérilisée (6ml) et la levures ade2 récoltés dans la boîte de pétri grâce à une anse de platine
-> Compter le nombre de cellule en suspension dans la solution à l’aide du calcul nommé la cellule de Thoma en utilisant un microscope optique. La solution extraite par une micro pipettes à côté du bec bunsen allumer pour assurer un maximum de stérilité. Ce dernier est basé sur un principe simple, il nécessite une lamelle spécifique à ce calcul de même qu’un microscope optique pour observer la solution qui sera mise dans cette lamelle spécifique qui a une surface de 0,0025 mm carré et une profondeur de 0,1 mm. Lorsqu’on observe la solution au microscope optique grâce a la lamelle utilisée un cadre quadrillé se laisse apparaître. Ce dernier nous permettra de calculer la cellule de Thoma au grossissement maximal. Il suffit de définir un grand carré composé de 16 petits carrés en sélectionné quatre partis ces derniers. Puis, comptabilisé le nombre de levures dans ceux choisis sans prendre compte des cellules qui touchent les bordures puis en faire une moyenne pour intégrer cette donnée dans le calcul donné.
-> introduire 0,1 µm du mélange de l’eau stérilisé et des levures ade2 dans chaque boîte de pétri en mettant en oeuvre les différents facteurs pour assurer un maximum de stérilité : porter l\’équipement de laboratoire nécessaire, mettre tout les matériaux utilisés dans le périmètre de manipulation à côté du ben bunsen allumé et désinfecté les outils entre chaque utilisation.
-> ensemencées la solution extraite en utilisant un râteau pour étaler les levures sur la surface de la boîte de pétri dans le même périmètre choisi
-> refermer les boîtes de pétri directement après avoir mis la solution sur la gélose
-> après avoir fini tout les échantillons passer les différents essais au temps choisi dans la lampe UV sauf les essais témoins (10 secondes ; 30 secondes ; 50 secondes ; 1 minute)
-> 5 essaies par temps choisi
-> laisser incuber les boîtes de pétri durant 6 jours afin de laisser la croissance des levures ade2 se faire
-> après incubation observer les différents essaies

VI.Aspects sécurité et environnement étique :
L’équipement de protection individuelle (EPI) est obligatoire dés l’entrée de l’apprentis scientifique dans le labo taire pour assurer la sécurité de l’élèves et de ses camarades. Cette équipement est constitué de la blouse de laboratoire de même que les lunettes de protection de plus et de gants. En addition, il est essentiel de jeter les déchets lors de l’expérience dans des poubelles destinés à de déchets d’activités de soins à risques infectieux afin d’éviter toutes intoxications, d’infections ou même d’allergies. Ils adaptent les différents natures de déchets en différents systèmes de récupération par question d’étique envers l’environnement.

VII. Résultats et analyse :
En premier lieu, la concentration en levures ade2 dans la solution qui sera ensemencée dans les boîtes de pétri a été calculé à l’aide d’une hématimètre nommé la cellule de Thoma. En utilisant le principe des dilutions en série, nous trouvons la quantité de levures dans la solution. Cette dernière dénombre 1,76 x 10 3 comme concentration de levures dans la solution utilisée lors de l’expérience.
Tout d’abord, on observe dans les boîtes témoins qui n’ont pas été exposés aux UV de nombreuses colonies rouges de même que l’apparition de colonies mutantes blanches. Ces dernières n’ayant pas été exposées à la lampe UV, il s’agit de mutation spontanée des clones. Dans les boîtes de pétris qui ont été soumises à 10 secondes aux rayons ultraviolets de type UVC, l’apparition de colonies mutantes blanches a lieu uniquement dans un des échantillons. De plus, la quantité de colonies rouges est moins élevée que dans les échantillons témoins. Puis, les échantillons ayant été exposés 30 secondes aux rayons ultraviolets UVC n’ont pas donné l’apparition à des clones blancs. De même, la quantité de colonies rouges est encore moins élevée que dans les échantillons observés auparavant. Cependant, une différence est apparue comparée aux précédentes, on a pu observer à une boîte de pétri contamine sur les cinq essaie mis en place pour ce temps. Cette dernière a dû être infectée par les contaminants lors de l’ouverture de la boîte pour l’ensemencer ou pendant l’exposition aux ultraviolets. Dans les boîtes de pétri qui ont été exposés 50 secondes aux lumières UVC de la lampe UV, on observe que la quantité visible de colonies rouge a encore diminué comparé aux précédentes. En addition, aucun clone blanc n’est apparu pour ces échantillons, on peut même observer une boîte de pétri n’ayant aucune colonie d\’aucun type. Finalement, les échantillons étant soumis à 1 minute aux lumières UVC n’ont eus aucunes colonies rouges visibles. De plus, les clones blancs ont fait l’apparition dans uniquement une des boîte de pétri. On retrouve le même cas de contamination déjà apparu dans l’un de ces échantillons.
Ce tableau de données représenté par un digramme ci-dessous montre graphiquement les résultats traités de mon expérience. En représentant le taux de colonies rouges dans les différents échantillons. Nous pouvons observer que le taux de colonies rouges diminue nettement durant cette expérience. Les boîtes témoins ont une moyenne de 10.6 néanmoins avec un grand écart type. Alors que les boîtes de pétris exposés au temps maximal d’exposition dénombrent aucune colonie rouge.

Graphique représentant les données traitées du taux de colonies rouges:

Par la suite, j’ai soumis les données du taux de colonies rouges au test ANOVA qui m’a permis de savoir si mes résultats étaient significatifs. Si la probabilité est inférieur à 0,5 cela prouve que le résultat est significatif alors que si il est supérieur cela prouve que les résultats ne sont pas significatifs. De même, ce test permet de savoir si notre hypothèse est confirmée.
Nous pouvons observer que pour le taux de colonies rouge, la probabilité est inférieur à 0,5. Cela prouve que le résultat est significatif.
Un tableau, ci-dessous montre graphiquement les données traitées des clones blancs observés dans les différents échantillon. Nous pouvons observer les moyennes de même que les écarts-type. Les résultats du taux de colonies mutées sont presque nuls à tous les différents taux d’exposition au rayonnement des ultraviolets.

Graphique représentant les données traitées du taux de colonie mutées

Nous pouvons observer que pour le taux de colonies mutées, la probabilité est supérieur à 0,5. Cela prouve que le résultat n’est pas significatif.
De même, on peut observer que les résultats n’était pas exactes par rapport a ce que la mutagenèse chez les UV sont censés provoqué chez les levures de type ade2 dans les expériences mis en place par des scientifiques. Dans les expériences similaires sur lesquelles je me suis informé le nombre de colonies, diminue considérablement avec le temps d’exposition aux UV qui augmente alors que le nombre de colonies blanches augmente avec l’augmentation du temps d’expositions aux UV. La diminution des colonies rouges est aussi visible dans mon expérience. Alors que dans mon expérience, l\’augmentation des colonies mutées n’est pas nettement visible. On ne peut même pas observer une variation tellement les résultats sont faibles. Cependant, il est essentiel de montrer les résultats de sa propre expérimentation même si ces derniers ne sont pas complètement fiables.

VIII. Conclusion :
Tout d’abord, l’exposition aux rayons ultraviolets de type UVC peuvent générer des réactions complexes et multiples nommé la mutation sur les levures ade2. Cependant, les levures ade2 peuvent muter de manière spontanée sans aucun contact avec l’agent mutagène dans cette expérience les rayons ultraviolets. Cette modification s’agit d’une mutation reverse ce définissant par la formation des clones blancs. Pour tout les autres boîte de pétri excepté les témoins, on observe de même plusieurs mutations, mais dans ce cas dus par le passage à la lampe UV, car ce contact augmente le taux de mutation reverse. Le contact avec cet agent mutagène a un effet létal sur les colonies de levures ade2. Lorsque la radiation modifie la molécule grâce à son énergie dans certains cas, la radiation modifie les propriétés de base de cette molécule par cet apport d’énergie. Dans certains cas d’un effet létal immédiat, l\’exposition aux rayons ultraviolets provoque la mort des cellules par leur dénaturation en déformant la molécule d’ADN ce qui provoque une diminution des clones observables. Cet effet létal rend l’organisme plus viable. Les polymérases de réparation sont censées résynthétisés ces molécules d’ADN. Cependant, si ces polymérases font une erreur au cours du processus, on peut observer l’apparition d’une mutation des colonies de levures ade2. Deux cas lors de ce processus peuvent avoir lieu, l’effet létal dans lequel la molécule meurt suite à la dénaturation soit l’effet mutagène qui provoque une mutation chez les colonies. De même, le taux de colonies mutées de couleur blanches augmente avec le temps d’exposition à l’agent mutagène. Toutes ces observations sont basées sur mon expérience et mes recherches personnelles en prenant en compte que la fiabilité de mon expérimentation n’est pas maximale. Car en comparant mon travail individuel à des expériences scientifiques basé sur la même question de recherche la diminution flagrante des colonies de même que l’augmentation des colonies blanches est nettement plus visible.

X. Evaluation :
Durant cette expérience, j’ai rencontré plusieurs point forts de même que de nombreuses pistes d’amélioration possible.
Tout d’abord le matériel mis à notre disposition nous permettre de suivre le protocole à la lettre. De plus certain outils tel que la micro-pipette ont une très faible incertitude afin qu’il y est une précision optimale dans nos manoeuvres. De plus les lamelles de la cellule de Thoma mis à notre disposition nous ont permis d’avoir la concentration de levures dans la solution utilisée durant l’expérience de manière très précise.
Puis, l’équipement de protection individuelle tel que la blouse, les lunettes de protection et les gants de même que le périmètre de manipulation mis en place grâce au bec bunsen activé nous assure la stérilisation constante durant l’expérience. A part lors de l’ensemencement des levures ou lors du passage sous la lampe émettant les ultraviolets, les boîte de pétri sont constamment close.
Finalement, la précision des résultats traités grâce aux ustensiles scientifiques de même que mathématiques qui nous aide a les fiabiliser comme les moyennes, les écarts-type et le test ANOVA.
Cependant, certaines pistes d’amélioration auraient été possibles afin de rendre cette expérience plus fiable.
Tout d’abord, selon la disposition de la boîte de pétri sous la lampe émettant les rayonnements ultraviolets, le faisceau de ce rayonnement n’as pas atteint de manière homogène toute la surface de la boîte de pétri. De plus, les différentes boîtes de pétri n’ont pas reçu identiquement la même dose de rayonnement ultraviolet. J’aurais dû dessiner des lignes délimitant la surface sur laquelle j’aurais disposé chacune des boîtes de pétris afin que le faisceau de rayonnement des ultraviolets soit égal pour tous.
De plus, les contenants de l’éthanol mis à notre disposition dans les laboratoires de l’institut été distribué de manière aléatoire. Ces derniers n’ont pas été soumis aux mêmes conditions d’utilisation par leurs anciens utilisateurs. En prenant en compte ce facteur, nos résultats auraient pu être faussés par l’ouverture du contenant, et même un contact avec un outil infecté. Malgré le respect de la stérilisation constante durant cette expérience.
De même, le nombre d’essais choisis par temps d’exposition aux UV est trop faible pour atteindre le maximum de fiabilité dans mes résultats. Le temps mis à notre disposition afin de respect le rendu de cette recherche individuelle de même que le matériel demandé ne m\’ont pas permis de reproduire cette expérience avec plus d\’essais pour chaque temps d’exposition.
En dernier temps, les temps d’exposition au faisceau du rayonnement des ultraviolets choisis ne sont pas les plus adéquats afin de ressortir des résultats qui confirme mon hypothèse. Alors que d’autres temps d’exposition auraient pu faire ressortir plus concrètement les résultats à mon expérience.

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